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L'analyse des images de puces à ADN

Version 1.6

• Les logiciels que nous utilisons sur la plate-forme
• Lancement de l'application
• Présentation de l'interface
• Acquisition de l'image
• Les différentes étapes de l'analyse d'images
• Liens utiles

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Utilisation d’un logiciel d’analyse d’image :

Sur la plate-forme de l’ENS, nous avons choisi de travailler avec le logiciel GenePix Pro, vous trouverez toutes les caractéristiques de ce logiciel sur le site Internet d’Axon.

Lancement de l’application :

Lors du démarrage de GenePix Pro, il est possible que certains messages d’alerte puissent apparaître. Nous allons vous décrire certains d’entre eux pour que vous sachiez quoi faire s’ils s’affichent à l’écran :

1. Au premier démarrage du logiciel, il peut vous demander quel mode de fonctionnement vous souhaitez utiliser. Cela dépend, bien entendu, de la façon dont vous avez scanné vos lames. Dans notre cas, nous sélectionnons le mode « deux couleurs ».
   
   
   
2. La fenêtre de mise à jour du logiciel apparaît ensuite. Il suffit de cliquer sur le bouton « Continue ».
   
   
   
3. GenePix Pro cherche au démarrage à se connecter à un scanner relié à la machine qui exécute l’application. Si l’ordinateur sur lequel vous travaillez n’est pas relié à un scanner ou s’il est éteint et que vous ne vous en servez pas, sélectionnez le mode « Analysis Only » :
   
   
   
4. Si aucun scanner n’est détecté, GenePix Pro vous demande quel modèle de scanner vous souhaitez émuler. Cela n’a pas beaucoup d’importance, mais il est sans doute préférable de choisir le modèle de scanner que vous avez utilisé pour scanner vos lames (par défaut choisir le 4000B).
   
   
   

Présentation de l’interface :

L’interface du logiciel se présente de la façon suivante (les captures d’écran sont réalisées à partir des versions 4.1 et 5.1 du logiciel) :

Elle est constituée d’onglet pour naviguer entre les différentes grandes fonctions du logiciel (visualisation de l’image, tableau de résultats, …). La fenêtre de l’onglet image se compose de 3 zones qui contiennent les outils de sélection et de navigation dans l’image, la zone de visualisation proprement dite au centre et sur la droite la palette des menus sous forme d’icônes.

La palette des outils en haut à gauche permet d’accéder aux différents réglages concernant l’image et la grille de spots :

En dessous de cette palette se trouve un outil qui permet de se focaliser sur un spot sur l’image (lorsque l’on clique dessus) et d’afficher son image dans les deux canaux avec les mesures des intensités :

Enfin à droite sont regroupées toutes les icônes qui donnent accès aux réglages des paramètres du scanner. On utilisera plus particulièrement pour la partie analyse d’image les icônes suivantes :

Acquisition de l’image :

Il est nécessaire de faire un premier passage de la lame « prescan » pour positionner la zone de scan de l’appareil.

Il est important de faire attention au choix des photo-multiplicateurs (PMT) et du gain des lasers car des valeurs trop extrêmes peuvent augmenter de façon artificielle le bruit électronique de l’appareil et sortir de la gamme de linéarité du scanner. Il est recommandé de faire les acquisitions à des valeurs moyennes (autour de 600-650). Il peut-être utile de faire plusieurs scans par lame à différents niveaux de réglage des PMT afin de déterminer l’offset dépendant des PMT.

En général, on utilise une taille de pixel de 10 µm en n’effectuant qu’un seul passage du scanner (lines to average = 1). Toutefois, effectuer 2 ou 4 passages permet de réduire le bruit électronique au prix de temps de lecture plus long.

Au fur et à mesure du scan, vérifier que l’image est bien équilibrée en allant dans « histogram » : les 2 courbes correspondant aux deux canaux d’acquisition doivent être superposées pour des intensités supérieures au bruit de fond.

Les différentes étapes de l’analyse d’images :

Dans la pratique, voici les différentes étapes à suivre pour effectuer l’analyse d’une image de puces à ADN avec le logiciel GenePix :

1. Ouvrir les images dans le logiciel avec l’option « Open Images » , les images sont au format TIFF. Vous pouvez enregistrer ces images sous deux formes. En un seul fichier TIFF, la gestion des fichiers est plus simple. Sous forme de fichiers multiples, les fichiers ainsi créés sont moins gros individuellement et vous pouvez ré-ouvrir vos images dans d’autres logiciels d’analyse d’image. Attention, nous vous recommandons cependant de toujours sauver sous la forme de deux fichiers TIFF, GenePix pouvant parfois avoir des comportements bizarres sur les fichiers uniques. Si vous ouvrez deux fichiers, il est impératif de les sélectionner tous les deux dans la boîte de dialogue.
   
   
   
   
2. Dans la fenêtre principale de GenePix, il y a plusieurs boutons à connaître :
   1. Tout d’abord le réglage de la luminosité et du contraste. En modifiant ces deux paramètres vous visualisez mieux vos spots sur la lame. Ces réglages ne modifient en rien les valeurs brutes, ils ne changent que leur représentation à l’écran.
   2. Ensuite le mode zoom qui vous permet de vous rapprocher de votre image, vous pouvez ainsi voir un bloc en particulier ou un spot en particulier. Vous pouvez toujours revenir au niveau de zoom précédent.
      
      
3. Vous devez maintenant charger la grille de référence sur votre image. Ce fichier au format GAL (Gene Array List) contient toutes les informations concernant chaque spot permettant de connaître le nom et la position des gènes sur la lame.
   
4. Utilisez la fonction Load Array List pour charger votre grille . La grille correspondant aux lames utilisées pendant la formation est disponible sur le site de la plate-forme de l’ENS. Attention à toujours enregistrer les fichiers en effectuant un clic droit sur le lien et en utilisant la fonction « Enregistrez la cible sous… » du menu contextuel.
   
   
   
   
   
   
5. Une fois la grille chargée, vous devez la positionner sur votre image. Pour cela vous devez vous positionner en mode bloc . Avec ce mode, vous pouvez sélectionner des blocs et les déplacer. Même si le logiciel est capable de positionner les blocs de façon automatique, il est indispensable de l’aider un peu en prépositionnant la grille. Pour vous faciliter le travail, poussez la luminosité et le contraste de façon à bien voir les spots même les faibles. Ensuite, utilisez le spot en bas à gauche de chaque bloc comme point de référence. En effet c’est le spot déposé en premier sur la lame. Attention, à bien vous placer en mode bloc et pas en mode création de bloc (la même icône mais avec un signe plus).
   
   
   
6. Enregistrez votre grille de paramètres qui est elle contrairement à la grille de gènes (GAL) spécifique de votre puce. Pour cela utilisez la fonction Save Settings. Ces paramètres sont enregistrés dans un fichier GPS (GenePix Settings).
   
   
7. Une fois la grille pré-positionnée, utilisez l’icône « cible » pour lancer la reconnaissance automatique des blocs. Une fois que GenePix a effectué sa reconnaissance, vous devez vérifier qu’il n’a pas fait d’erreur (ligne de spots oubliés, mélange entre les blocs…). Pour cela vous pouvez déplacer un seul bloc précisément. Ensuite utilisez la même icône pour trouver les spots (features) à l’intérieur de chaque bloc.
   
   
   
8. Pensez à sauvegarder régulièrement votre grille de paramètres.
   
   
9. L’étape suivante consiste à regarder spot par spot les problèmes qui pourraient se poser. Plusieurs choses peuvent arriver : GenePix peut avoir mal entouré le spot, avoir rejeté un spot que vous considérez comme correct ou avoir accepté un spot artefactuel. Cette étape est la plus fastidieuse et dépend beaucoup de la qualité de l’image obtenue. Plus l’image est belle moins cette étape prend de temps.
   
10. Pour travailler, vous devez passer en mode spot (feature mode) . Et vous pouvez déplacer les spots, agrandir leur taille ou la diminuer et leur ajouter une étiquette (flag) si vous souhaitez les éliminer par exemple. Cette étape est importante surtout pour supprimer les artefacts qui pourraient créer des faux positifs, par exemple une poussière avec une fluorescence dissymétrique. Il faut donc bien veiller à éliminer ces spots et surtout à ne pas hésiter à retourner à l’image pour vérifier vos résultats.
    
    
11. Les différents types de « flag » que l’on peut obtenir avec GenePix sont les suivants :
    

    Spot Absent (-75)	Spot Non Trouvé (-50)	Mauvais Spot (-100)

    
    
12. En effectuant un clic droit en mode « feature » sur un spot on accède à un menu contextuel qui permet d’accéder aux paramètres d’un spot, avec entre autre la possibilité d’y affecter un « flag » défini :
    
    
    
13. Une fois que votre image a été bien vérifiée, vous pouvez lancer l’analyse à savoir la transformation des pixels de l’image en valeurs d’intensités. Il vous faut alors aller dans l’onglet d’analyse pour pouvoir visualiser vos résultats. Enregistrez vos résultats, le fichier est sous la forme d’un fichier GPR (GenePix Results).
    
    
    
    
    
    
14. Au moment de l’enregistrement GenePix peut afficher un message vous indiquant que certain spots n’ont pas d’identifiant unique. C’est normal. Il s’agit des spots vides marqués « empty ». Attention toutefois à les supprimer pour ne plus avoir à les prendre en compte dans la suite des analyses.
    
    
    
15. Vous êtes maintenant prêt à normaliser vos données.

Liens utiles :

• GenePix® Pro est le logiciel d'acquisition et d'analyse à quatre canaux pour les biopuces à ADN et protéines, les puces tissues et cellules, ainsi que pour les études de fluorescence. Site web : http://www.axon.com/gn_GenePixSoftware.html